序章：星塵祭的劫難
百年一度，星塵會如雨般降落在蘑菇王國，這一天被稱為「星塵祭」。 瑪利歐收到碧姬公主的邀請函，歡欣鼓舞地前往城堡參加慶典。然而，當他抵達時，天空突然變色。大魔王庫巴率領著巨大的飛行戰艦艦隊發動了突襲。這一次，庫巴不只是綁架公主，他召喚了一艘巨大的 UFO，利用雷射將整座碧姬城堡連根拔起，連同公主一起帶往了浩瀚的宇宙。 瑪利歐試圖阻止，卻被卡美克（Kamek）的魔法擊中，從高空墜落，消失在星海之中。
第一章：星之子與神秘的天文台
瑪利歐在一個名為「天堂之門」的小星球上醒來。他遇見了一群像是星星的小生物——奇可（Luma）。 通過與奇可們的互動，瑪利歐見到了這裡的主人，一位神秘的高雅女性——羅潔塔（Rosalina）。 羅潔塔是「掃帚星天文台」的主人，也是奇可們的「媽媽」。她告訴瑪利歐，庫巴偷走了驅動天文台的能量源「力量星星（Power Stars）」與核心「大星星（Grand Stars）」，導致天文台失去了航行能力。如果瑪利歐能找回這些星星，天文台就能恢復力量，帶他前往宇宙中心拯救公主。 為了協助瑪利歐，一隻杏色的奇可決定與瑪利歐合體，賦予了他能在宇宙中自由飛翔與攻擊的「旋轉（Spin）」能力。
第二章：跨越銀河的冒險
瑪利歐以天文台為據點，穿梭於各個奇妙的銀河（Galaxy）。 從蜜蜂王國、幽靈鬼屋到充滿岩漿與冰雪的星球，瑪利歐解救了同樣流落宇宙的奇諾比奧探險隊（雖然隊長是個膽小鬼），並與原本被困的路易吉重逢。 隨著收集到的力量星星越來越多，天文台的各個區域（圓頂）逐一解鎖：露台、浴室、廚房、臥室、機房…… 瑪利歐也多次與庫巴二世（Bowser Jr.）及其巨大的機器人兵器交戰，一一奪回了被竊的大星星。
在此期間，瑪利歐在圖書室閱讀了羅潔塔念給奇可們聽的繪本，揭開了這位神秘女子的過去（詳見後文【專題解析：羅潔塔的身世】）。
第三章：宇宙中心的決戰
當所有的大星星被收回，掃帚星天文台終於恢復了原本的姿態——一艘巨大的星際飛船。 羅潔塔啟動天文台，化作一顆巨大的彗星，強行衝破了庫巴艦隊的防線，直抵宇宙的中心。 在那裡，庫巴正在利用奪來的力量創造屬於他自己的銀河帝國。 瑪利歐衝入被改造的碧姬城堡，穿越重重機關，最終在一個類似太陽的恆星核心與庫巴展開了決戰。 這場戰鬥規模空前，庫巴甚至會將自己縮成巨大的岩石球體。經過激烈的交鋒，瑪利歐在岩漿與星辰的見證下，將庫巴打入了滾燙的恆星之中。
終章：超新星與宇宙的重生
戰敗的庫巴墜落，瑪利歐救出了碧姬公主。 然而，庫巴製造的銀河帝國因為失去了核心力量，開始崩潰。這顆人造太陽發生了超新星爆炸，產生了一個巨大的黑洞。 黑洞開始無情地吞噬周圍的一切：庫巴的戰艦、碧姬城堡、甚至連天文台都即將被吸入。眼看宇宙即將毀滅，一直陪伴在瑪利歐帽兜裡的奇可，以及天文台所有的奇可們，突然飛向了黑洞。 它們犧牲了自己，衝入黑洞中心引發了連鎖反應。 「只要是為了心愛的人，變成星星也是一種幸福。」 在耀眼的光芒中，奇可們化解了黑洞，並引發了一場新的「大霹靂（Big Bang）」。宇宙被重塑了。
尾聲：歡迎來到新銀河
當瑪利歐再次睜開眼睛時，他發現自己回到了蘑菇王國的城堡前。 碧姬公主、路易吉、奇諾比奧們，甚至連庫巴和他的手下們都在。大家彷彿什麼事都沒發生過一樣，在明媚的陽光下慶祝著。 但瑪利歐知道有些事情改變了。他抬頭望向天空，巨大的羅潔塔幻影微笑著對他說： 「生命的循環是不會結束的。星屑會變成奇可，奇可會變成星星，星星會變成星球……雖然循環往復，但沒有一次是完全相同的重複。」
宇宙重生了，雖然看似回到了原點，但這是一個全新的、充滿希望的新銀河。 瑪利歐對著天空大喊：「Welcome! Welcome New GALAXY!!」
【真結局】 如果收集齊全 120 顆星星，結局會追加一段畫面： 羅潔塔站在天文台上，對著瑪利歐所在的星球輕聲說了句「謝謝」，隨後駕駛天文台飛向了宇宙深處，繼續她守護星之子的旅程。而在一顆小星球上，有一顆新生的奇可破土而出，象徵著生命的延續。
【專題解析：羅潔塔的身世之謎】
遊戲中通過繪本暗示了羅潔塔悲傷的過去： 很久以前，一個小女孩（羅潔塔）遇到了一隻尋找媽媽的奇可。女孩為了幫它，搭乘父親的飛船飛向宇宙。 旅途中，女孩意識到自己的母親已經去世，再也回不來了。她在星空下哭泣，但奇可安慰了她。最終，女孩決定成為所有無家可歸的奇可們的「媽媽」，並建立了天文台作為家園。 繪本中有許多細節暗示了羅潔塔可能與瑪利歐世界人物的關聯：
她有一位留著鬍子的父親（暗示瑪利歐？）。
她的母親長得像碧姬公主。
她有一個穿綠衣服的弟弟（暗示路易吉？）。 結合結局羅潔塔所說的「宇宙輪迴論」，有一種廣為流傳的推測是：羅潔塔可能是來自另一個輪迴（或未來）的瑪利歐與碧姬的女兒。她穿越了無數次宇宙的生滅，守護著星之子們。
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